Obsah
- stupňa
- Metóda 1 Identifikujte baktériu Gramovým farbením
- Metóda 2 Vykonajte test farbenia Ziehl-Neelsen
- Metóda 3 Študujte správanie a vzhľad baktérií
- Metóda 4 Interpretujte všetky výsledky
Identifikácia baktérií je zložitá úloha. Jedným z dôvodov je, že podľa odhadov je na svete medzi 10 000 a 1 miliardou bakteriálnych druhov! Správna identifikácia baktérií je veľmi dôležitá, najmä v lekárskej oblasti, kde správne liečenie choroby do značnej miery závisí od typu mikróbov, ktoré spôsobujú problém. Vo väčšine prípadov sa identifikácia robí na základe eliminácie. Na identifikáciu baktérie musíte vykonať testy sfarbenia, analyzovať jej vzhľad a pozorovať, ako dobre reaguje na rôzne podmienky. Ak potrebujete rýchly výsledok, odoberte vzorku DNA na odoslanie do laboratória.
stupňa
Metóda 1 Identifikujte baktériu Gramovým farbením
- určiť ak sú baktérie grampozitívne alebo negatívne. Gramovo farbenie je metóda rozdelenia baktérií medzi dva najbežnejšie typy: grampozitívne a gramnegatívne. Prvý z nich má hrubú bunkovú stenu pozostávajúcu z polyméru nazývaného peptidoglykán, ktorý má najlepšie zafarbenie ako tenké steny gramnegatívnych baktérií.
- Niektoré bežné typy grampozitívnych baktérií sú streptokoky, stafylokoky, mikrokoky (alebo mikrokoky) a listérie.
- Tu je niekoľko bežných príkladov gramnegatívnych baktérií: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium a Campylobacter.
- Prijmite vhodné ochranné opatrenia. Baktérie a chemické prvky, ktoré použijete počas testu, predstavujú riziko pre vaše zdravie. Pri vykonávaní testu sfarbenia noste ochranné okuliare, jednorazové nitrilové rukavice a laboratórny plášť. Po dokončení uložte rukavice a všetky ďalšie kontaminované materiály do špeciálneho vrecka. Nezabudnite postupovať podľa pokynov svojho laboratória, aby ste sa zbavili vrecka na kontaminované výrobky.
- Vzorku umiestnite na sklenenú podložnú sklíčku. Na začatie testu položte kvapku alebo bakteriálnu vzorku na sterilné podložné sklíčko. Potom prepláchnite čepeľ nad Bunsenovým horákom zapáleným trikrát, aby ste vzorku opravili a zabránili tomu, aby pri oplachovaní alebo pridávaní reagencií vypadla z platne.
- Do čepele pridajte 5 kvapiek fialového kryštálu. Na vzorku nalejte päť kvapiek roztoku kryštálovej fialovej. Počkajte minútu, kým vzorka absorbuje kryštalickú fialovú.
- Čepeľ držte na mieste špendlíky, aby ste si neznečistili ruky.
- Čepeľ dôkladne umyte, aby ste odstránili škvrnu. Použite kohútik alebo vytlačenú fľašu a nechajte vodu prúdiť veľmi pomaly až päť sekúnd, aby ste odstránili zvyšky atramentu, ktoré sa na vzorke nepriľnuli.
- Na podložné sklíčko nalejte päť kvapiek Gramovej diódy. Je to roztok pozostávajúci z diódy, hydrogenuhličitanu sodného a jodidu draselného, ktorý spôsobuje, že sa kryštálová violeť topí s bunkovými stenami baktérií. Nalejte päť kvapiek roztoku na vzorku a nechajte pôsobiť jednu minútu.
- Umyte vzorku alkoholom alebo kyselinou mliečnou. Alkohol a lacetón sú bieliace činidlá a eliminujú zafarbenie bakteriálnych bunkových stien, ak sú gramnegatívne. Na vzorku nalejte niekoľko kvapiek bielidla a nechajte pôsobiť najviac tri sekundy. Potom skúste jemne opláchnuť vodou po dobu 5 sekúnd, aby sa tieto bieliace prostriedky odstránili.
- Ak necháte bielidlo dlhodobo pôsobiť, môže to viesť k zániku gramnegatívnych baktérií, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom.
- Vykonajte kontrastný test so safranínom. Safranin je červené farbivo, ktoré kontrastuje s krištáľovo fialovou, a preto sfarbuje baktérie, ktoré nie sú ovplyvnené fialovým sfarbením. Nalejte asi päť kvapiek safranínu na vzorku a nechajte pôsobiť jednu minútu. Potom skúste jemne opláchnuť vodou po dobu piatich sekúnd.
- Vizualizujte svoju vzorku pri 1000-násobnom zväčšení. Baktérie sa stanú fialovými alebo fialovými, ak sú grampozitívne, alebo ružové, ak sú gramnegatívne kvôli safranínu.
Metóda 2 Vykonajte test farbenia Ziehl-Neelsen
- Použite túto techniku na detekciu kyslých baktérií. Tieto druhy obsahujú väčšie množstvo lipidov, vďaka ktorým sú odolnejšie voči farbivám použitým pri farbení podľa Grama. Baktérie odolné voči kyselinám patria do rodu Mycobacterium, ktorý zahŕňa baktériu zodpovednú za tuberkulózu (M. tuberculosis). Na farbenie baktérií odolných voči kyselinám musíte použiť červené farbivo zvané karbolický fuchsín, ktoré je odolné voči oplachovaniu kyslými alebo sírnymi roztokmi.
- Prijmite vhodné ochranné opatrenia. Chemické a biologické materiály používané pri farbení Ziehl-Neelsen môžu byť nebezpečné. Okrem toho budete musieť použiť aj zdroje tepla, napríklad Bunsenovu dýzu, elektrický ohrievač alebo alkoholovú lampu. Vykonajte test podľa pokynov nižšie.
- Nasaďte si ochranné okuliare, nitrilové rukavice a laboratórny plášť.
- Dávajte pozor, aby ste nevdychovali výpary z farbív a bielidiel a aby kvapky nevystrekovali vaše oči ani pokožku. Nádoby udržiavajte otvorené pod kapotou.
- Pri zahrievaní čepele buďte veľmi opatrní. Väčšina použitých chemikálií je horľavá. Na podložných sklíčkach alebo iných zariadeniach môžu byť tiež stopy horľavých látok.
- Pripravte čepeľ. Pri kruhovom pohybe rovnomerne rozmiestnite malé množstvo bakteriálnej vzorky do stredu sterilného podložného sklíčka. Vaša vzorka by mala zaberať približne 10 mm x 20 mm.
- Nôž vysušte. Nôž umiestnite na sušiacu štruktúru tak, aby vzorka smerovala nahor. Nechajte prirodzene zaschnúť 30 sekúnd. Nepokúšajte sa čepeľ sušiť handričkou.
- Vzorku zaistite teplom. So vzorkou hore posuňte čepeľ dvakrát alebo trikrát cez osvetlený Bunsenov horák. Môžete tiež umiestniť čepeľ na elektrický ohrievač nastavením teploty medzi 65 ° C a 75 ° C najmenej na dve hodiny. Dávajte pozor, aby ste vzorku nevarili alebo nespálili.
- Pridajte karbolický fuchsín do čepele. Nalejte niekoľko kvapiek tohto roztoku na podložné sklíčko. Nalejte dosť na úplné zakrytie vzorky.
- Zahrejte čepeľ, aby sa farbivo fixovalo. Sklíčko opatrne zahrejte nad Bunsenovým horákom alebo alkoholovou lampou tak, aby vzorka smerovala nahor, alebo ju vložte na elektrický ohrievač. Nôž zahrievajte na 60 ° C alebo dovtedy, kým sa nezačne uvoľňovať para. Nechajte farbivo pôsobiť päť minút.
- Ak používate elektrický ohrievač, zapnite ho pri 60 ° C. Ak sa rozhodnete pre alkoholovú lampu alebo horák Bunsen, mali by ste očakávať, že uvidíte výpary.
- Aby ste ostali pri požadovanej teplote päť minút, občas ju zohrejte.
- Dávajte pozor, aby ste vzorku nevarili, nespálili alebo nevysušili.
- Opláchnite čepeľ studenou vodou. Nechajte vychladnúť päť minút a jemne opláchnite niekoľko sekúnd čistou vodou. Na odstránenie škvŕn z farbiva, ktoré nepriľnuli k vzorke, použite vodovodnú vodu alebo stlačenú fľašu.
- Nalejte vzorku kyslý alkohol alebo kyselinu sírovú. Na úplné zakrytie vzorky použite objem 3% (objem / objem) alkoholu alebo 20% kyselinu sírovú. Kyselinu nechajte pôsobiť, až kým farba nezmizne a nedosiahne veľmi svetlý ružový odtieň. Tento proces zvyčajne trvá asi desať minút.
- Opláchnite čepeľ čistou vodou. Jemne umyte čepeľ pod tečúcou vodou alebo pomocou stláčacej fľaše. Odstráňte všetky zvyšky kyselín a farbív.
- Pridajte kontrastnú látku. Po opláchnutí sklíčka nalejte farbu malachitovej zelene alebo metylénovej modrej. Tieto dve riešenia vytvárajú modrasté alebo zelenkavé pozadie, na ktorom sa objaví červené farbivo, ako aj ďalšie biologické materiály, ako sú ľudské bunky a baktérie odolné voči kyselinám. Nechajte látky pôsobiť jednu až dve minúty.
- Čepeľ opláchnite a osušte. Dôkladne opláchnite vodou, aby ste odstránili nadmerný kontrast. Po dokončení osušte zadnú časť čepele suchou handričkou a nechajte ju prirodzene uschnúť na stojane.
- Vizualizujte svoju vzorku pri 1000-násobnom zväčšení. Baktérie odolné voči kyselinám sa sfarbia na červenú alebo tmavo ružovú. Ostatné baktérie, nebakteriálne bunky a spodná strana čepele sa zmení na zelenú alebo modrú.
Metóda 3 Študujte správanie a vzhľad baktérií
- Analyzujte tvar baktérií. Po vykonaní testu sfarbenia, aby sa určilo, či sú baktérie gram-pozitívne, gram-negatívne alebo kyselinovzdorné, je čas presnejšie identifikovať druh. Najprv analyzujte tvar baktérií na podložnom sklíčku. Tri najbežnejšie formy sú koky (sférické), špirály a bacily (tyčový tvar).
- Existuje niekoľko variantov týchto foriem. Napríklad okrúhle baktérie (koky) sa môžu vyskytovať v pároch (diplococci), v reťazcoch, v halách alebo v skupinách po štyroch (tetrad).
- Zistite, či je baktéria aeróbna alebo anaeróbna. Odoberte dve vzorky baktérií a vytvorte dve samostatné kultúry. Mesiac musí byť anaeróbny (pestovaný bez kyslíka), zatiaľ čo druhý musí byť aeróbny (pestovaný s kyslíkom). Pred pozorovaním rastu uchovajte anaeróbnu kultúru pri 35 ° C na mieste bez kyslíka najmenej 48 hodín.
- Ak baktérie rastú v prostredí bez kyslíka, ale nie pri vystavení kyslíku, znamená to, že sú anaeróbne.
- Hoci sa vyvíjajú v okysličenom prostredí, ale nie v neprítomnosti kyslíka, sú aeróbne.
- Keď sa vyvíjajú v oboch prostrediach, hovoríme o fakultatívnych anaeróbnych baktériách.
- Vykonajte test pohyblivosti. Baktéria je mobilná, ak sa môže pohybovať sama s jedným alebo viacerými bičíkom. Stupeň pohyblivosti je veľmi dôležitý pri identifikácii určitých bakteriálnych druhov. Existuje niekoľko druhov pohyblivosti, ale najbezpečnejším a najčiteľnejším spôsobom je polotuhé médium.
- Vytvorte kultúru pre test motility. Pripravte si kultúru baktérií v kultivačnej pôde. Podľa pokynov nižšie pripravte vývar podľa vášho výberu.
- Inokulujte kultúru na polotuhý agar na testy motility. Potiahnite časť kultúry vývaru sterilnou očkovacou ihlou. Ihlu opatrne zasadte do polotuhej dagarovej skúmavky, ako je napríklad TTC lagar, ktorú ste si pripravili na test. Ihla musí preniknúť do 2/3 agaru.
- Po dokončení opatrne vyberte ihlu a dávajte pozor, aby ste neprekročili limity zóny očkovania.
- Skúmavka sa inkubuje pri 30 ° C počas 48 hodín.
- Prečítajte si výsledok testu. Agar na motilitu sa po kontakte s baktériami zmení na červený. Ak sú mobilné, tento červený alebo ružovkastý odtieň sa rozšíri po celej látke. Inak bude zafarbenie obmedzené na miesto vpichu.
Metóda 4 Interpretujte všetky výsledky
- Zhromaždite svoje komentáre. Ak chcete poznať druh baktérie, musíte zhromaždiť informácie získané z kultúr, testy sfarbenia a pozorovania foriem. Ak skúmate vzorky pacienta, príznaky, ktoré sa vyskytujú, môžu tiež pomôcť určiť, ktorý druh baktérií je vhodný.
- Napríklad, ak testy ukážu, že baktérie sú gramnegatívne, anaeróbne, nepohyblivé a ak u pacienta zistíte príznaky, ako sú bolesť brucha, nevoľnosť a zvracanie, je pravdepodobné, že pacient trpí infekciou bakteriálnymi baktériami. fragilis.
- Prezrite si databázu. Na svete existujú tisíce druhov baktérií. Nie je možné vedieť všetko srdcom. Aby ste mohli porovnať výsledky testov s informáciami o bakteriálnych druhoch, budete pravdepodobne musieť navštíviť klinickú mikrobiologickú knihu alebo online databázu.
- Existujú vynikajúce online zdroje na identifikáciu baktérií, ale väčšina z týchto databáz je k dispozícii v angličtine vrátane Patricbrc.org a GlobalRPh. Užitočné informácie však stále nájdete na webovej stránke Medzinárodného centra mikrobiálnych zdrojov INRA.
- Vykonajte genetický test, aby ste poznali presný druh baktérie. V niektorých prípadoch budete možno musieť identifikovať druhy baktérií. Najrýchlejšou a najjednoduchšou metódou je vykonanie testu DNA. Testy DNA sú užitočné aj na identifikáciu baktérií rezistentných na tradičné formy farbenia a kultivácie. V súčasnosti sú testy DNA na mikroorganizmoch veľmi rýchle a môžu byť pripravené za menej ako dve hodiny.
- Ak nemáte prístup do laboratória, ktoré vykonáva genetické sekvenovanie mikroorganizmov, pošlite bakteriálnu vzorku do špecializovanej agentúry.